Real-Time PCR (qPCR)

qPCR (Real-Time PCR) מאפשר כימות מדויק של DNA ו-RNA בזמן אמת, תוך כדי תהליך ההגברה המולקולרי – ללא צורך בהרצת ג'ל או בפתיחת המבחנה בסיום הריצה. לאורך הסייקלים, המכשיר מודד את עליית סיגנל הפלואורסצנציה ומתרגם אותו לערך ה-Ct (או Cq value). נתון זה מאפשר לחשב את כמות חומר המוצא בדיוק מירבי ובטווח דינמי של 7–8 סדרי גודל. זו הסיבה ש-qPCR הפך לסטנדרט הזהב באקדמיה ובתעשייה, החל מאנליזות של ביטוי גנים ועד לאבחון קליני של פתוגנים

כמה עולה מכשיר qPCR?

טווחי המחיר למכשירי qPCR רחבים — ממכשירי entry-level בסביבות $15,000 ועד מכשירים מקצועיים מלאים ב-$150,000 ומעלה. ההבדלים נובעים בעיקר מפורמט הפלייט (96 מול 384 באריות), מספר ערוצי הפלואורסצנציה, יכולות ה-HRM (High Resolution Melt), והתאמה לתקני איכות רגולטוריים (IVD). מכשירי ddPCR של Bio-Rad מהווים קטגוריה נפרדת ומתומחרים בנפרד.
עלויות הריצה השוטפות — מאסטר מיקס (Master Mix), פרובים ומתכלים — משתנות משמעותית לפי היצרן, כימיית הניסוי, ורמת ה-multiplexing. מכשירים המבוססים על ריאגנטים ייעודיים של היצרן מונעים את היכולת להשתמש בחומרים חלופיים ומשאירים אתכם תלויים במחירון של חברה בודדת. למעבדות עם נפח הרצה גבוה כדאי לחשב את עלות הריצה לדגימה לצד מחיר המכשיר עצמו.

איך עובד qPCR?

qPCR מגביר רצף DNA ומודד פלואורסצנציה בזמן אמת בכל מחזור של הגברה. ככל שהמטרה מוגברת, הפלואורסצנציה עולה. המחזור שבו היא חוצה את רמת הסף נקרא ערך ה-Ct (Cycle Threshold) — והוא ביחס הפוך לכמות החומר ההתחלתי: Ct נמוך משמעו כמות גדולה של חומר התחלתי. הטווח הדינמי (Dynamic Range) המקובל הוא 7–8 סדרי גודל — בין עותק בודד לעד מאה מיליון עותקים בתגובה אחת.
שתי כימיות מרכזיות:

SYBR Green — צבע שנקשר ל- DNA דו-גדילי. פשוט וזול: אין צורך בעיצוב פרוב ספציפי. החיסרון: לא מבחין בין התוצר אמפליפיקציה הרצוי לבין primer-dimers — נדרשת עקומת התכה (Melt Curve) לאחר הריצה לאישור ספציפיות.
פרובים של TaqMan — פרוב עם ריפורטר (Reporter) וקוונצ'ר (Quencher) שנקשר לרצף המטרה הספציפי. ספציפיות גבוהה, מאפשר מולטיפלקס — אבל כל ניסוי חדש דורש סינתזת פרוב מותאם.

RT-qPCR: כשמתחילים מ-RNA (כמו בניסויי ביטוי גנים), מוסיפים שלב של Reverse Transcription שממיר את ה-RNA ל-cDNA לפני ה-PCR. המכשיר זהה; ההבדל הוא בהכנת הדגימה ובמאסטר מיקס.

מה להשוות כשבוחרים מכשיר?

מספר ערוצי פלואורסצנציה — 2–3 ערוצים מספיקים לניסויי singleplex עם בקרות. 4 ערוצים מכסים את רוב הצרכים המחקריים (מטרה + 2 בקרות + גן ייחוס). 5–6 ערוצים: לפאנלים מולטיפלקס מתקדמים ואבחון פתוגנים. חשוב לוודא: כמה ערוצים שמישים בפועל מבלי שתתרחש זליגה (Cross-talk) בין צבעי הריפורטר השונים — ולא להסתמך רק על המספר המוצג במפרט היצרן.

מערכת פתוחה מול מערכת סגורה — רוב הפלטפורמות המרכזיות (Thermo QuantStudio, Bio-Rad CFX Opus, QIAGEN Rotor-Gene Q, Analytik Jena qTOWER) תומכות במאסטר מיקס של כל יצרן. מכשירי Roche LightCycler מוטים לכימיה של Roche. מערכת סגורה נועלת את המעבדה לתמחור ספק יחיד לריאגנטים ומתכלים — עלות שמצטברת לאורך שנים.

אחידות תרמית וגרדיאנט טמפרטורה — אחידות הטמפרטורה בין הבאריות משפיעה ישירות על עקביות ערך ה-Ct. קריטי יותר בפורמט 384, שבו שונות בין-באריות משמעותית יותר. בלוק מהיר (ramp rate גבוה) מקצר ריצה אך עלול לפגוע בעקביות.

יכולת HRM — HRM (High Resolution Melt) נדרש לגנוטייפינג וסריקת ווריאנטים ללא פרובים ספציפיים. נתמך ברוב הפלטפורמות המרכזיות, לרוב כמודול תוכנה נפרד. לפני רכישה: לאשר שהדגם תומך ב-HRM, שמודול התוכנה כלול בהצעה, ושכימיית הצבע הנדרשת מאומתת למכשיר.

תוכנה ועמידה רגולטורית — מעבדות מחקר: קלות שימוש ואפשרויות ייצוא נתונים. סביבות מוסדרות (GLP): audit trail, בקרת גישה משתמשים. מודולי רגולטוריים נרכשים לרוב כרישיון נפרד — יש לוודא שהם כלולים בהצעת המחיר.

אוטומציה ואינטגרציה — תמיכה מובנית או פרוטוקול API פתוח לרובוטיקה (Liquid handlers) ומערכות LIMS. רלוונטי במיוחד למרכזי תשתיות (Core facilities) ולמעבדות עם תפוקה גבוהה. מומלץ לוודא מול הנציג המקומי את זמינות התמיכה הטכנית לאינטגרציה.

שירות מקומי — כדאי לבדוק את זמן התגובה של מהנדסי השירות בארץ, זמינות לביצוע כשירות תקופתית (IQ/OQ/PQ) במעבדות מוסדרות, ומלאי חלקי חילוף ומכשירי גיבוי זמינים מקומית למניעת השבתת המחקר.

יצרנים ונציגיהם בישראל

מכשירים

Roche 🇨🇭
LightCycler 96 ו-LightCycler 480 — 96 ועד 384 בארות, עד 6 ערוצי פלואורסצנציה, אפשרויות IVD. מוטה לכימיה של Roche — לבדוק תאימות ריאגנטים של צד שלישי מול הנציג לפני רכישה.|

Bio-Rad 🇺🇸
סדרת CFX Opus — פלטפורמת qPCR פתוחה לכימיה של כל יצרן. Bio-Rad היא גם ספקית ddPCR (QX200 / QX ONE).|

QIAGEN 🇩🇪
Rotor-Gene Q — פורמט רוטרי ייחודי במקום פלייט שטוח, כימיה פתוחה.|

Analytik Jena 🇩🇪
סדרת qTOWER — מכשירי qPCR עם פורמט 96 ו-384 בארות, כימיה פתוחה.|

Standard Bio 🇺🇸
BioMark-X (Fluidigm) — טכנולוגיית מיקרופלואידיקה המאפשרת עד 9,216 תגובות qPCR במקביל על גבי צ'יפ יחיד. מערכת ייעודית המיועדת למרכזי גנומיקה, סריקות גנטיות רחבות ומעבדות בעלות תפוקה גבוהה.|

ריאגנטים

Thermo (LS) 🇺🇸
SYBR Green, פרובים של TaqMan, מאסטר מיקסים ל-RT-qPCR; מוצרי Invitrogen ל-PCR.|

Meridian (Bioline) 🇬🇧
מאסטר מיקסים SensiFAST ל-qPCR ו-RT-qPCR; מגוון ריאגנטים ל-Real-Time PCR.|

AnyGenes 🇫🇷
פריימרים לפאנלים SignArray לניתוח qPCR של מסלולי איתות (signaling pathways); מאסטר מיקסים ומוצרים נוספים.|

NEB 🇺🇸
מאסטר מיקסים מסדרת Luna ל-qPCR ו-RT-qPCR (Universal, Probe, Multiplex), כולל LunaScript ל-cDNA.|

Jena Bioscience 🇩🇪
מאסטר מיקסים, qPCR SYBRMaster, qPCR ProbesMaster, qPCR MultiplexMaster, כולל גרסאות lyophilized.|

PCR Biosystems 🇬🇧
מאסטר מיקסים ל-qPCR ו-RT-qPCR, Hot Start Taq DNA Polymerase.|

Takara Bio 🇯🇵
ערכות סינתזת cDNA, אנזימי PCR, SMART-Seq.|

QIAGEN 🇩🇪
סדרות המאסטר מיקס QuantiTect ו-QuantiNova ל-qPCR ו-RT-qPCR.|

Zymo Research 🇺🇸
ZymoTaq qPCR PreMix — מתאים ל-HRM ולניתוח מתילציה (bisulfite-treated DNA); ZymoScript One-Step RT-qPCR Kit.|

MP Biomedicals 🇺🇸
מאסטר מיקסים ל-qPCR מבוססי SYBR Green; ערכות סינתזת cDNA, dNTPs ומתכלים ל-PCR.|

פריימרים ופרובים

IDT 🇺🇸
פריימרים (Primers), פרובים מותאמים ל-qPCR, gBlocks; עיצוב ניסויים ל-Real-Time PCR.|

Biosearch Technologies (LGC) 🇺🇸
פרובים של BHQ ו-Locked Nucleic Acid (LNA) ל-qPCR; ערכות KASP לגנוטייפינג בתפוקה גבוהה.|agentek

מתכלים

Axygen 🇺🇸
פלייטים ל-PCR (96 ו-384 בארות), מבחנות, סרטי איטום.|

לפני שמבקשים הצעת מחיר

• מפו את התפוקה האמיתית שלכם — כמה תגובות בשבוע/חודש? זה קובע אם יש צורך בפורמט של 96 או 384 באריות — ואם בכלל כדאי לרכוש מכשיר לעומת עבודה דרך core facility.
• הגדירו את צרכי המולטיפלקס — כמה מטרות בו-זמנית? אילו צבעי ריפורטר? בקשו מהספק מטריצת תאימות צבעים לניסוי המתוכנן — לא רק את מספר הערוצים במפרט.
• בדקו אם המערכת סגורה — האם תשתמשו אך ורק בריאגנטים של היצרן, או שחשובה לכם גמישות? שאלו במפורש אם הפלטפורמה עובדת עם מאסטר מיקסים של חברות אחרות.
• הבהירו את דרישת ה-HRM — וודאו אם הדגם תומך ב-HRM, אם מודול התוכנה כלול, ואם כימיית הצבע שלכם מאומתת.
• הבינו את הדרישות הרגולטוריות — GLP, 21 CFR Part 11, IVD — כל אחת מהן דורשת יכולות תוכנה ואישורי מכשיר שונים.
• בקשו הצעת עלות כוללת — מכשיר + חוזה שירות שנתי + הערכת עלות מתכלים לשנה. מכשיר "זול" עם כימיה סגורה יכול להיות יקר יותר לאורך זמן ממכשיר יקר יותר עם כימיה פתוחה.
• ודאו תמיכת שירות מקומי — שאלו את משך הזמן לקריאת שירות ומלאי חלפים זמין בארץ.

שאלות נפוצות

ש: מה ההבדל בין qPCR ל-RT-qPCR?
ת: qPCR מודד טמפלט של דנ"א באופן ישיר. RT-qPCR מוסיף שלב של Reverse Transcription שממיר RNA ל-cDNA לפני הגברת ה-PCR — זהו הסטנדרט לניסויי ביטוי גנים מדגימות RNA. המכשיר זהה לחלוטין; ההבדל הוא בהכנת הדגימה ובמאסטר מיקס.

ש: האם ניתן להשתמש במאסטר מיקס של כל יצרן?
ת: ברוב פלטפורמות המחקר — כן. Thermo QuantStudio, Bio-Rad CFX Opus, QIAGEN Rotor-Gene Q ו-Analytik Jena qTOWER הן פלטפורמות פתוחות שתומכות בריאגנטים של צד שלישי. מכשירי Roche LightCycler מוטים לכימיה של Roche.

ש: מתי כדאי לשקול Digital PCR במקום qPCR?
ת: המעבר ל-dPCR מומלץ בעיקר בשלושה תרחישים: (1) כאשר עובדים עם דגימות בריכוז קיצוני נמוך, שבהן ערכי ה-Ct/Cq גבוהים באופן עקבי (לרוב מעל מחזור 30) והשונות בין הרפליקות גבוהה; (2) כאשר הדגימות מכילות מעכבי PCR חזקים (כמו בדגימות דם, קרקע או שפכים) המונעים כימות מדויק ב-qPCR; ו-(3) כאשר נדרשת רגישות קיצונית לזיהוי מוטציות נדירות (למשל, תדירות אלל של פחות מ-1%).

ש: האם מכשיר qPCR מתאים לאבחון קליני?
ת: חלק מהמכשירים נושאים אישור IVD (In Vitro Diagnostic) ומאפשרים דיווח קליני מוסדר. מכשירי מחקר אינם מיועדים לדיווח קליני ללא ולידציה עצמאית. אם מתוכנן שימוש קליני — לאשר סטטוס IVD בהצעת המחיר.

ש: מה זה HRM ומתי צריך אותו?
ת: HRM (High Resolution Melt) הוא ניתוח עקומת התכה (Melt Curve) בדיוק גבוה שמתבצע לאחר ה-PCR — מאפשר להבחין בין אמפליקונים לפי התנהגות ההתכה שלהם. שימושי לגנוטייפינג, סריקת ווריאנטים וזיהוי מינים ללא פרובים ספציפיים. נתמך ברוב הפלטפורמות המרכזיות, לרוב כמודול תוכנה נפרד.

מקור: biofindly.co.il · Real-Time PCR (qPCR)