סינתזת אוליגו

הסינתזה מתבצעת בכיוון הפוך מבתא ביולוגי, מקצה 3' לקצה 5', כאשר בכל מחזור מתווסף בסיס אחד לשרשרת. יעילות כל מחזור גבוהה אך אינה מלאה, ולכן ככל שהרצף ארוך יותר כך גדל שיעור המקטעים הקטועים בתערובת. מכאן נגזרת חשיבות הניקוי: אוליגו קצר לשימוש כפריימר סטנדרטי מספיק לרוב בניקוי בסיסי (Desalting), ואילו אוליגו ארוך, אוליגו מסומן או כזה המיועד לשיבוט ולעבודה תפקודית מחייב ניקוי ב-HPLC או בג'ל, המסלק את התוצרים החלקיים. במקביל קיימות מודיפיקציות רבות שניתן להזמין — סימון פלואורסצנטי, Quencher, ביוטין, פוספט בקצה או קשרים עמידים לנוקלאזות — וכל אחת מהן משפיעה על אופן הייצור ועל הניקוי הנדרש.

את ההזמנה מכתיבים היישום וכמות החומר. סקאלת הסינתזה קובעת את התפוקה, ולפריימר לשימוש שוטף די בסקאלה הקטנה ביותר, שכן הכמות המתקבלת בה מספיקה לאלפי תגובות. עיצוב הרצף עצמו הוא שלב נפרד המשפיע על ההצלחה: אורך, תכולת GC, טמפרטורת ההיתוך וסכנת היווצרות מבנים משניים או דימרים בין הפריימרים נבדקים לפני ההזמנה. בעבודה בהיקף גבוה קיימת גם אספקה בפורמט פלטה, המגיעה מסודרת מראש לפי מיקום ומתאימה לעבודה עם אוטומציה.

לפני ביצוע ההזמנה, מומלץ לוודא אילו מסמכי QC מלווים את המשלוח, ובראשם תעודת אנליזה (CoA) המפרטת את ה-Yield המדויק, הריכוז ואנליזת ספקטרומטריית מסות לאימות משקל מולקולרי מדויק. חשוב לבדוק את זמן האספקה לישראל, שהוא לרוב הגורם המשמעותי בלוח הזמנים ומשתנה בין אוליגו סטנדרטי לאוליגו מסומן. כדאי לברר אם החומר מסופק בצורה יבשה (Lyophilized) או כתמיסה מוכנה (Resuspended) ובאיזה בופר (כגון TE Buffer או Nuclease-free water), שכן חומר בתמיסה חוסך שלב אך מגביל את הריכוז. באוליגו המיועד לעבודה רגישה יש לוודא היעדר נוקלאזות ולבדוק את רמת הטוהר המובטחת לאחר הניקוי.