⏱ 8 דקות קריאה
· 🖨️ הדפס / שמור PDFqPCR (Real-Time PCR) מאפשר כימות מדויק של DNA ו-RNA בזמן אמת, תוך כדי תהליך ההגברה המולקולרי – ללא צורך בהרצת ג'ל או בפתיחת המבחנה בסיום הריצה. לאורך הסייקלים, המכשיר מודד את עליית סיגנל הפלואורסצנציה ומתרגם אותו לערך ה-Ct (או Cq value). נתון זה מאפשר לחשב את כמות חומר המוצא בדיוק מירבי ובטווח דינמי של 7–8 סדרי גודל. זו הסיבה ש-qPCR הפך לסטנדרט הזהב באקדמיה ובתעשייה, החל מאנליזות של ביטוי גנים ועד לאבחון קליני של פתוגנים
| ניסוי | גישה מומלצת | פרמטרים טיפוסיים |
|---|---|---|
| ביטוי גנים | RT-qPCR עם SYBR Green או פרובים של TaqMan | בחירת גנים לבקרת ייחוס (Housekeeping) |
| זיהוי פתוגנים | qPCR במולטיפלקס (Multiplexing) | גבול הגילוי (LOD) |
| עומס ויראלי (קליני) | מערכות מותאמות דיאגנוסטיקה | אישורי תקינה רפואית (CE-IVD) |
| ווריאציות בספירת עותקים (CNV) | כימות יחסי מול לוקוס ייחוס | עדיפות לשילוב עם Digital PCR |
| גנוטייפינג / SNP | שימוש בפרובים או אנליזת HRM | אנליזת עקומת התכה (High Resolution Melting) |
| ניסוי מולטיפלקס | qPCR עם 4–6 ערוצי צבע | הפרדה ספקטרלית ומניעת זליגת צבעים |
| בקרת ספריות NGS | כימות פונקציונלי ב-qPCR | דיוק בריכוז הספרייה הסופי (nM) |
| ניתוח מתילציה | PCR מתילציה-ספציפי (MSP) | DNA שעבר המרה ביסולפיט (Bisulfite) |
טווחי המחיר למכשירי qPCR רחבים — ממכשירי entry-level בסביבות $15,000 ועד מכשירים מקצועיים מלאים ב-$150,000 ומעלה. ההבדלים נובעים בעיקר מפורמט הפלייט (96 מול 384 באריות), מספר ערוצי הפלואורסצנציה, יכולות ה-HRM (High Resolution Melt), והתאמה לתקני איכות רגולטוריים (IVD). מכשירי ddPCR של Bio-Rad מהווים קטגוריה נפרדת ומתומחרים בנפרד.
עלויות הריצה השוטפות — מאסטר מיקס (Master Mix), פרובים ומתכלים — משתנות משמעותית לפי היצרן, כימיית הניסוי, ורמת ה-multiplexing. מכשירים המבוססים על ריאגנטים ייעודיים של היצרן מונעים את היכולת להשתמש בחומרים חלופיים ומשאירים אתכם תלויים במחירון של חברה בודדת. למעבדות עם נפח הרצה גבוה כדאי לחשב את עלות הריצה לדגימה לצד מחיר המכשיר עצמו.
| סוג מכשיר | טווח מחיר (USD) |
|---|---|
| מכשיר entry-level (96 בארות, 2–3 ערוצים) | $15,000–$25,000 |
| מכשיר mid-range (96 בארות, 4–6 ערוצים) | $25,000–$60,000 |
| מכשיר high-end (384 בארות, HRM, אפשרות IVD) | $60,000–$150,000 |
טווחי המחירים מבוססים על מחירונים גלובליים ומקורות ציבוריים, ומשמשים להתמצאות בלבד. המחיר בפועל בישראל נקבע מול הנציג ומושפע מתצורת המערכת, חוזה שירות, הכשרה, מכס ומע״מ.
עלויות שלא תמיד מופיעות בהצעת המחיר: חוזה שירות שנתי, מודולי תוכנה כמו HRM ו-audit trail (לרוב ברישיון נפרד), התקנה וכשירות (IQ/OQ/PQ) במעבדות מוסדרות, מתכלים ייעודיים של היצרן (פלייטים, סרטי איטום), וסינתזת פרובים מותאמים לכל ניסוי.
qPCR מגביר רצף DNA ומודד פלואורסצנציה בזמן אמת בכל מחזור של הגברה. ככל שהמטרה מוגברת, הפלואורסצנציה עולה. המחזור שבו היא חוצה את רמת הסף נקרא ערך ה-Ct (Cycle Threshold) — והוא ביחס הפוך לכמות החומר ההתחלתי: Ct נמוך משמעו כמות גדולה של חומר התחלתי. הטווח הדינמי (Dynamic Range) המקובל הוא 7–8 סדרי גודל — בין עותק בודד לעד מאה מיליון עותקים בתגובה אחת.
שתי כימיות מרכזיות:
RT-qPCR: כשמתחילים מ-RNA (כמו בניסויי ביטוי גנים), מוסיפים שלב של Reverse Transcription שממיר את ה-RNA ל-cDNA לפני ה-PCR. המכשיר זהה; ההבדל הוא בהכנת הדגימה ובמאסטר מיקס.
פרוטוקול מהיר מול סטנדרטי: פרוטוקול סטנדרטי אורך כ-120 דקות (לרוב 35–40 מחזורים). פרוטוקול מהיר אורך כ-45 דקות ומגדיל את התפוקה (Throughput).
עלות הריצה השוטפת תלויה בכימיית הניסוי, ברמת ה-multiplexing, ובמדיניות הפלטפורמה — פתוחה מול סגורה. פלטפורמה עם כימיה סגורה נועלת אתכם לתמחור ספק יחיד לכל ריצה; פלטפורמה פתוחה מאפשרת להתמחר ריאגנטים בחופשיות. למעבדה בעלת נפח הרצה גבוה כדאי לקחת בחשבון עלות לדגימה לצד מחיר המכשיר עצמו.
חוזי שירות למכשירי מחקר נעים בטווח רחב בהתאם ליצרן ורמת הכיסוי. מכשירי IVD הדורשים תיעוד IQ/OQ/PQ מלא כרוכים בעלות גבוהה יותר. יש לתקצב גם כיול שנתי של ערכות הצבעים לניסויים מולטיפלקס.
עלות תכנון חד-פעמית לכל ניסוי + עלות סינתזה חוזרת. TaqMan assays מסחריים מאומתים מהווים הוצאה קבועה וצפויה. פיתוח ניסוי מותאם (מטרה חדשה, אורגניזם לא סטנדרטי) דורש מספר איטרציות תכנון — יש לתקצב בנפרד.
dPCR עובד באופן שונה מהותית: הוא מחלק את התגובה לאלפי טיפות (ddPCR) או מיני-באריות, מריץ כל יחידה עד נקודת קצה (End-point), וסופר כמה מהן חיוביות — ומשם מחשב עותקים/µL ישירות, ללא עקומת כיול. זה מה שמעניק ל-dPCR עדיפות בכימות מוחלט וברגישות גבוהה בריכוזים נמוכים במיוחד.
PCR רגיל מציג בנד על ג'ל. qPCR מציג מספר. כשתשובה בינארית מספיקה, PCR רגיל פשוט וזול יותר. כשנדרשת מדידה, qPCR הוא הכלי הנכון — אבל מגיע עם פרמיה משמעותית בעלות ובמורכבות.
LightCycler 96 ו-LightCycler 480 — 96 ועד 384 בארות, עד 6 ערוצי פלואורסצנציה, אפשרויות IVD. מוטה לכימיה של Roche — לבדוק תאימות ריאגנטים של צד שלישי מול הנציג לפני רכישה.
סדרת CFX Opus — פלטפורמת qPCR פתוחה לכימיה של כל יצרן. Bio-Rad היא גם ספקית ddPCR (QX200 / QX ONE).
Rotor-Gene Q — פורמט רוטרי ייחודי במקום פלייט שטוח, כימיה פתוחה.
סדרת qTOWER — מכשירי qPCR עם פורמט 96 ו-384 בארות, כימיה פתוחה.
BioMark-X (Fluidigm) — טכנולוגיית מיקרופלואידיקה המאפשרת עד 9,216 תגובות qPCR במקביל על גבי צ'יפ יחיד. מערכת ייעודית המיועדת למרכזי גנומיקה, סריקות גנטיות רחבות ומעבדות בעלות תפוקה גבוהה.
SYBR Green, פרובים של TaqMan, מאסטר מיקסים ל-RT-qPCR; מוצרי Invitrogen ל-PCR.
מאסטר מיקסים SensiFAST ל-qPCR ו-RT-qPCR; מגוון ריאגנטים ל-Real-Time PCR.
פריימרים לפאנלים SignArray לניתוח qPCR של מסלולי איתות (signaling pathways); מאסטר מיקסים ומוצרים נוספים.
מאסטר מיקסים מסדרת Luna ל-qPCR ו-RT-qPCR (Universal, Probe, Multiplex), כולל LunaScript ל-cDNA.
מאסטר מיקסים, qPCR SYBRMaster, qPCR ProbesMaster, qPCR MultiplexMaster, כולל גרסאות lyophilized.
מאסטר מיקסים ל-qPCR ו-RT-qPCR, Hot Start Taq DNA Polymerase.
ערכות סינתזת cDNA, אנזימי PCR, SMART-Seq.
סדרות המאסטר מיקס QuantiTect ו-QuantiNova ל-qPCR ו-RT-qPCR.
ZymoTaq qPCR PreMix — מתאים ל-HRM ולניתוח מתילציה (bisulfite-treated DNA); ZymoScript One-Step RT-qPCR Kit.
מאסטר מיקסים ל-qPCR מבוססי SYBR Green; ערכות סינתזת cDNA, dNTPs ומתכלים ל-PCR.
פרובים של BHQ ו-Locked Nucleic Acid (LNA) ל-qPCR; ערכות KASP לגנוטייפינג בתפוקה גבוהה.
פלייטים ל-PCR (96 ו-384 בארות), מבחנות, סרטי איטום.
qPCR מודד טמפלט של דנ"א באופן ישיר. RT-qPCR מוסיף שלב של Reverse Transcription שממיר RNA ל-cDNA לפני הגברת ה-PCR — זהו הסטנדרט לניסויי ביטוי גנים מדגימות RNA. המכשיר זהה לחלוטין; ההבדל הוא בהכנת הדגימה ובמאסטר מיקס.
ברוב פלטפורמות המחקר — כן. Thermo QuantStudio, Bio-Rad CFX Opus, QIAGEN Rotor-Gene Q ו-Analytik Jena qTOWER הן פלטפורמות פתוחות שתומכות בריאגנטים של צד שלישי. מכשירי Roche LightCycler מוטים לכימיה של Roche.
המעבר ל-dPCR מומלץ בעיקר בשלושה תרחישים: (1) כאשר עובדים עם דגימות בריכוז קיצוני נמוך, שבהן ערכי ה-Ct/Cq גבוהים באופן עקבי (לרוב מעל מחזור 30) והשונות בין הרפליקות גבוהה; (2) כאשר הדגימות מכילות מעכבי PCR חזקים (כמו בדגימות דם, קרקע או שפכים) המונעים כימות מדויק ב-qPCR; ו-(3) כאשר נדרשת רגישות קיצונית לזיהוי מוטציות נדירות (למשל, תדירות אלל של פחות מ-1%).
חלק מהמכשירים נושאים אישור IVD (In Vitro Diagnostic) ומאפשרים דיווח קליני מוסדר. מכשירי מחקר אינם מיועדים לדיווח קליני ללא ולידציה עצמאית. אם מתוכנן שימוש קליני — לאשר סטטוס IVD בהצעת המחיר.
HRM (High Resolution Melt) הוא ניתוח עקומת התכה (Melt Curve) בדיוק גבוה שמתבצע לאחר ה-PCR — מאפשר להבחין בין אמפליקונים לפי התנהגות ההתכה שלהם. שימושי לגנוטייפינג, סריקת ווריאנטים וזיהוי מינים ללא פרובים ספציפיים. נתמך ברוב הפלטפורמות המרכזיות, לרוב כמודול תוכנה נפרד.
מדריכים נוספים יתווספו בקרוב — qPCR, centrifuges, NGS sequencers ועוד.
דיווח על טעות
כדי לאמת בעלות על חברה, עליך להצטרף לקהילת BioFindly כנציג חברה רשמי
נראה שאתה מחובר כמשתמש רגיל.
כדי לאמת בעלות על חברה, יש להירשם כנציג חברה רשמי.
התחבר ל-BioFindly כדי לשמור ספקים ולהיות מוכן להצעת המחיר הבאה.