נוגדנים משניים

את הנוגדן המשני בוחרים לפי שני נתונים של הנוגדן הראשוני: המין המארח (Host Species) שבו הוא יוצר, וה-Isotype שלו (כגון IgG או IgM). נוגדן ראשוני שיוצר בעכבר מחייב נוגדן משני Anti-Mouse, בעוד המין המארח של הנוגדן המשני עצמו חייב להיות שונה משניהם (למשל Goat Anti-Mouse). הסימון הנישא על הנוגדן המשני קובע את שיטת הגילוי: צימוד לאנזים HRP או AP מתאים ל-Western Blot ול-ELISA ומייצר אות כימילומינסנטי או צבעוני, ואילו צימוד לפלואורופור נדרש במיקרוסקופיה ובציטומטריית זרימה. בנוסף קיימת מערכת ביוטין-סטרפטאבידין, שמוסיפה שלב הגברה נוסף ומשמשת כשריכוז המטרה נמוך במיוחד.

איכות התוצאה נקבעת בעיקר לפי רמת הטיהור של הנוגדן. נוגדנים שעברו ספיחה צולבת (Cross-Adsorbed) עברו ניקוי מול אימונוגלובולינים ממינים אחרים כדי למנוע תגובתיות צולבת (Cross-reactivity) – צעד הכרחי בצביעות מרובות (Multiplexing) או בעבודה על רקמה המכילה נוגדנים עצמיים.

לפני רכישה כדאי לבדוק שהפלואורופור מתאים לספקטרום העירור והפליטה של המכשיר שבשימוש, ולוודא הפרדה מספקת בין הצבעים כשמריצים כמה מטרות במקביל. חשוב לברר לאילו יישומים הנוגדן מאומת ובאיזה מייהול עבודה, מכיוון שנוגדן מרוכז מדי הוא סיבה שכיחה לרקע גבוה ולא תמיד מזוהה ככזו. מאחר שנוגדנים מסומנים בפלואורופור רגישים לאור ולהפשרות חוזרות, יש להקפיד על תנאי האחסון ועל חלוקה לאליקוטים בקבלת המוצר. בעבודה עם דגימות אנושיות יש לוודא בנוסף שהנוגדן אינו מגיב עם אימונוגלובולינים אנושיים.