Western Blot

תהליך ה-Western Blot מורכב מארבעה שלבים עיקריים. הפרדה בג'ל פוליאקרילאמיד בתנאים דנטורטיביים (SDS-PAGE) מסדרת את החלבונים לפי גודל; העברה (Transfer) מעבירה אותם מהג'ל אל ממברנת ניטרוצלולוזה או PVDF; חסימה (Blocking) בתמיסת חלב או אלבומין (BSA) תופסת את האתרים הפנויים על הממברנה ומונעת קשירה לא ספציפית; ולבסוף גילוי באמצעות נוגדן ראשוני ונוגדן משני מסומן. שיטת הגילוי הנפוצה היא כמילומינסנציה (ECL), שבה האנזים HRP מפרק סובסטרט ופולט אור הנקלט בסורק או בפילם.

בחירת הרכיבים נגזרת מאופי החלבון ומהרגישות הנדרשת. ממברנת PVDF קושרת חלבונים בעוצמה גבוהה יותר ועמידה לשטיפות חוזרות ולניקוי הממברנה (Stripping), בעוד ניטרוצלולוז מספק רקע נמוך ומתאים יותר לחלבונים קטנים. העברה רטובה ממושכת מתאימה לחלבונים גדולים, ואילו מערכות חצי יבשות מקצרות את זמן ההעברה משמעותית. גילוי פלואורסצנטי מאפשר כימות מדויק יותר וזיהוי של כמה מטרות באותה ממברנה, אך מחייב סורק ייעודי. סולם משקלים מסומן מראש נבחר לפי טווח הגודל של החלבון הנבדק.

לפני רכישה כדאי לוודא שג'לים מוכנים מראש מתאימים לתא ההרצה הקיים במעבדה, שכן מידות הקסטה, עובי הג'ל ומיקום הבארות משתנים בין יצרנים, וכך גם ערכות ההעברה המהירה שמותאמות למכשיר מסוים בלבד. בבחירת סובסטרט ECL כדאי להתאים את עוצמת האות לרגישות הנדרשת, שכן סובסטרט חזק מדי מביא את הגלאי לרוויה (Saturation) ומקשה על כימות של חלבון בריכוז גבוה. עבור חלבון בעל שכיחות נמוכה, נתוני הרגישות של הסובסטרט משמעותיים יותר מהעלות לתגובה.